МЕТОД АВТОМАТИЗИРОВАННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОГО ЛИЗОЦИМА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ

Аннотация

Лизоцим – термостабильный гидролитический фермент мурамидаза, расщепляющий β-гликозидные связи между аминосахарами пептидогликана клеточной стенки бактерий. Лизоцим является фактором врождённого иммунитета человека и животных, присутствует в различных биологических жидкостях человека и клетках крови, обладает антибактериальными, противовирусными, противогрибковыми и иммуномодулирующими свойствами. Лизоцим человека подобен лизоциму из куриных яиц, что позволяет использовать последний как лечебный препарат и в биотехнологии.
Цель исследования – разработка простого, быстрого, точного, экономичного и воспроизводимого количественного метода определения активного лизоцима для анализа биологических жидкостей в клинике в норме и при патологических состояниях, лизоцим-содержащих лечебных и биотехнологических препаратов, а также научно-исследовательских целей.
Для выполнения метода необходимы 2 коммерческих препарата (лизоцим и лиофилизированный препарат Micrococcus lysodeikticus) и любой планшетный фотометр с программным обеспечением. Проведён анализ биологической жидкости человека (слюны), коммерческого лечебного препарата в форме таблеток для рассасывания Лизоцим+Пиридоксин и экспериментального биотехнологического препарата, содержащего иммуноглобулины и лизоцим. Анализ проводился в 96-луночном полистироловом планшете и позволял одновременно исследовать до 78 различных образцов в реакции ферментативного расщепления M. lysodeicticus.
Разработан автоматизированный метод определения концентрации активного лизоцима, подобраны и отработаны условия постановки реакции: длина волны, буферный раствор, температура, время и условия внесения образцов, время проведения реакции, время пригодности субстрата, автоматизация учёта. Содержание активного лизоцима в слюне человека, измеренное разработанным методом, составило 1,62-155,27 мкг/мл. Измерено содержание лизоцима в лечебном препарате и экспериментальном биотехнологическом препарате иммуноглобулинов, содержащем лизоцим.
Разработан количественный метод определения активного лизоцима для анализа биологических и биотехнологических образцов, показавший высокую точность с коэффициентом вариации при многократных постановках, не превышающем 15,5 %.
Ключевые слова: лизоцим; автоматизированный метод; количественное определение; активный лизоцим; биологические жидкости; лизоцим-содержащие препараты

Annotation

Lysozyme is a thermostable hydrolytic muramidase enzyme that cleaves β–glycoside bonds between peptidoglycan amino sugars of the bacterial cell wall. Lysozyme is a factor in the innate immunity of humans and animals, is present in various human biological fluids and blood cells, and has antibacterial, antiviral, antifungal, and immunomodulatory properties. Human lysozyme is similar to lysozyme from chicken eggs, which makes it possible to use the latter as a therapeutic drug and in biotechnology.
The aim of the study is to develop a simple, fast, accurate, economical and reproducible quantitative method for the determination of active lysozyme for the analysis of biological fluids in the clinic in normal and pathological conditions, lysozyme-containing therapeutic and biotechnological preparates, as well as scientific research purposes.
To perform the method, two commercial preparates (lysozyme and lyophilized Micrococcus lysodeikticus) and any ELISA-photometer with software are required. The analysis of human biological fluid (saliva), a commercial therapeutic drug in the form of tablets for resorption (Lysozyme+Pyridoxine) and an experimental biotechnological preparate containing immunoglobulins and lysozyme was carried out. The analysis was performed in a 96-well polystyrene plate and allowed simultaneous examination of up to 78 different samples in the enzymatic cleavage reaction of M. lysodeicticus.
An automated method for determining the concentration of active lysozyme has been developed, the reaction conditions have been selected and worked out: wavelength, buffer solution, temperature, time and conditions of sample application, reaction time, substrate suitability time, accounting automation. The content of active lysozyme in human saliva, measured by the developed method, was 1,62 – 155,27 micrograms/ml. The lysozyme content was measured in a therapeutic drug and an experimental biotechnological preparate of immunoglobulins containing lysozyme.
A quantitative method for the determination of active lysozyme for the analysis of biological and biotechnological samples has been developed, which has shown high accuracy with a coefficient of variation in multiple settings not exceeding 15,5 %.
Key words: lysozyme; automated method; quantitative determination; active lysozyme; biological fluids; lysozyme-containing drugs

Об авторах

Список литературы

Ключевые слова